Padronização extração DNA de micobactérias fixadas em lâminas coradas de baciloscopia – Aplicação para o diagnóstico e estudos epidemiológicos da hanseníase e da tuberculose

Resumo

Introdução: a hanseníase é uma doença infecciosa antiga, prevalente em países pobres, com mais de 200 mil novos casos em 2019. O Brasil enfrenta desafios na erradicação, especialmente no Nordeste. Devido à impossibilidade de cultivar o Mycobacterium leprae em laboratório, métodos moleculares, como a extração de DNA para estudos de epidemiologia molecular, são essenciais para o diagnóstico e controle da doença. Objetivo: Padronização extração DNA de micobactérias fixadas em lâminas coradas de baciloscopia. Metodologia: o estudo utilizou cepas de vacinas BCG (Mycobacterium bovis) para fixação e coloração de lâminas histológicas. As amostras, obtidas da Secretaria Municipal de Saúde de Mossoró, foram diluídas, coradas pelo método de Ziehl-Neelsen e analisadas pelo microscópio. Em seguida, as lâminas coradas foram raspadas para a futura extração do material genético. Além disso, amostras de vacinas em diferentes concentrações foram preparadas para extração, totalizando 10 amostras: cinco obtidas por raspagem de lâminas e cinco consistindo de vacina adicionada diretamente aos eppendorfs de extração. A extração do DNA envolveu lise celular com guanidina-HCl, precipitação com isopropanol, centrifugação e lavagem com etanol. O DNA extraído foi amplificado a submetido a eletroforese. Resultados e discussão: o método de extração de DNA com guanidina demonstrou-se eficaz para o Mycobacterium bovis, evidenciado pela identificação de quatro amostras de vacinas BCG após PCR. A temperatura ideal para amplificação foi estabelecida em 66°C com uso de gradiente na termocicladora. Nos testes com raspados de lâminas, não houve detecção de DNA após eletroforese, sugerindo possível falha na raspagem devido à dificuldade de visualização e baixa concentração de material, que não foi quantificada antes da PCR. Em contrapartida, as amostras das vacinas diluídas reagiram positivamente em quatro de cinco testes. Conclusão:  pesquisa demonstrou que o método de extração de DNA com guanidina é promissor, evidenciado pelo sucesso da eletroforese em quatro amostras. A temperatura ideal para amplificação de Mycobacterium bovis foi estabelecida em 66°C. Contudo, as cinco amostras obtidas por raspagem de lâminas histológicas resultaram negativas, indicando necessidade de ajustes na transferência do material genético. Em síntese, o método de PCR foi parcialmente padronizado.