Desenvolvimento e padronização de imunodiagnóstico para Linfadenite caseosa

Resumo

O diagnóstico clínico da Linfadenite caseosa (LC) pode ser dificultado devido a sua forma visceral, na qual os ovinos e caprinos não apresentam sinais visíveis, e permanece sem ser diagnosticada até o abate. Dessa forma, o diagnóstico sorológico se torna o mais adequado para o controle da LC, sendo capaz de detectar a doença nos animais assintomáticos. O ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA) é o principal teste sorológico utilizado, um método econômico e facilmente aplicável na rotina laboratorial. Além disso, a combinação de proteínas recombinantes tem gerado resultados promissores para a espécie ovina, mas pouco tem sido descrito em caprinos. Deste modo, o presente trabalho tem como propósito desenvolver e padronizar um ELISA indireto utilizando as proteínas recombinantes rPLD, rCP01850 e rCP40 para diagnóstico de linfadenite caseosa em caprinos. A padronização do ELISA foi realizada através do método Checkerboard titration para obtenção das concentrações das proteínas, dos soros e do anticorpo conjugado mais adequadas ao ensaio, por meio do uso de um pool de soros positivos e um pool de soros negativos. O ELISA indireto foi validado através de 40 soros caprinos negativos provenientes de rebanhos sem sinais de LC e áreas não-endêmicas, e 40 positivos de caprinos com LC clínica, com confirmação microbiológica. Os testes foram realizados em duplicata. Placas de poliestireno de 96 poços, foram sensibilizadas com 100µL por poço contendo 2,0 µg/mL de proteína recombinante (na proporção 1:1:1 de rPLD, rCP01850 e rCP40), diluída em tampão carbonato bicarbonato pH 9,6, e incubado a 4ºC durante 16h. O bloqueio realizado com PBS-T com 5% de leite em pó desnatado durante 2h a 37°C. As amostras de soro foram utilizadas na diluição de 1:50, cada placa contando com um controle positivo, um controle negativo e um branco (apenas PBS-T sem soro animal), e incubado por 1h a 37°C. Como anticorpo secundário usou-se o conjugado IgG anti-cabra marcado com peroxidase, na diluição de 1:40.000, e incubou-se durante 45 minutos a 37°C. Para revelação, usou-se o tampão citrato-fosfato pH 4,0, OPD e peróxido de hidrogênio, e deixado à temperatura ambiente e em local escuro por 15 minutos. As reações foram paradas com solução de ácido sulfúrico à 5%, e a leitura da absorbância foi realizada em espectrofotômetro no comprimento de onda de 492 nm. Os resultados das absorbâncias foram expressos em média ± desvio padrão. Para análise estatística o software SPSS v. 12.0 (IBM) foi usado para gerar a curva ROC e estabelecer os valores de especificidade, sensibilidade e acurácia. A partir da curva ROC gerada, estabeleceu-se como ponto de corte o valor de 0,26975, tendo em vista que este valor gerou os valores máximos de 90% sensibilidade e 90% de especificidade, além de uma acurácia global de 96,6%. Em conclusão, a combinação das proteínas rPLD, rCP40 e rCP01850 usada em ELISA indireto é uma estratégia promissora para o imunodiagnóstico de LC em rebanhos caprinos.