Triagem de primers ISSR visando seleção de marcadores com potencialidades para identificação de linhas mutantes M4 de melancia

Resumo

Cucurbitáceas de importância agronômica como a Melancia (Citrullus lanatus) crescem seus valores de produção a cada ano, ocupando o Brasil a quinta posição no ranking mundial (FAOSTAT, 2022). Diferentes fatores de natureza biótica e abiótica associados a interação de genes e ambiente afetam a qualidade dessa fruta. Como alternativa promissora, tem-se a obtenção de novos cultivares por melhoramento genético através da indução de variação genética com mutações aleatórias artificiais. Contudo, para conhecer as características herdáveis ao longo de gerações e predizer alterações no DNA, são necessárias aplicações de estudos moleculares. O presente trabalho buscou selecionar e avaliar marcadores ISSR (Inter simple-sequence repeats) capazes de detectar polimorfismos em linhas mutantes M4 tratadas com raios gama como passo inicial para estudos posteriores de diversidade genética e estabelecimento de novas cultivares associadas a caracteres agronômicos de interesse. Quatro linhas da geração M4 de tratamento com raios gama 400 Gy (57, 58, 156 e 199) com oito sementes cada foram semeadas em bandejas contendo substrato comercial (Topstrato), conjuntamente com um grupo controle de oito sementes não irradiadas (Top seed) durante dez dias. Passado o tempo, foram transplantadas para horta didática da Universidade Federal do Semi-árido (UFERSA) regadas diariamente até o surgimento da primeira flor, estágio de desenvolvimento onde foram colhidas cinco folhas jovens de cada planta, transportadas em sacos plásticos previamente identificados até o laboratório e armazenadas em freezer -20°C. A extração de DNA foi realizada a partir do protocolo CTAB proposto por Doyle e Doyle (1987), com posterior visualização e quantificação do material genético obtido por eletroforese em gel de agarose a 1% a 120V corado com brometo de etídeo (10 mg/mL) e registro em fotodocumentador. O DNA de dois indivíduos que apresentaram maior integridade e quantidade foram então diluídos para a concentração de 10 ng/μl, seguido da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) com 23 primers ISSR comerciais (Gbt oligo) durante 35 ciclos com MIX composto por 30 ng de DNA molde, 0,83 μM primer, 1x Taq-Buffer MgCl2 (Sinapse Inc.), 0,16 mM dNTP (Ludwig Biotec), 1U/μl Taq DNA-polimerase (Sinapse Inc.), 0,208 mg/mL BSA e água-ultrapura q.s.p, revelado por eletroforese em gel de agarose 2%. A partir da seleção com base na integridade e quantidade, sucedeu-se as amplificações com todos os DNAS. Houve sucesso na extração do DNA pelo método de CTAB. As amostras 67:3 e 199:1 foram escolhidas para a seleção de marcadores por apresentarem maior quantidade de DNA obtido (80 ng/μl). Sendo observado que 11 (DiCA5’CY, DiGA3’C, TriCAC3’RC, TriGTG, TriGTG5’CY, TriGTG3’YC, TriTGT5’CY, TriTCA3’RC, TriTCC3’RC, TriTGA3’RC e TriCGA3’RC) dos 23 primers ISSR testados apresentaram amplificação, sendo oito deles considerados polimórficos. Viabilizando estudos posteriores voltados à otimização das condições de PCR, diversidade genética e caracterização das linhas mutantes.