Avaliação da integridade do DNA de células testiculares de catetos (pecari tajacu) cultivadas in vitro utilizando o marcador laranja de acridina

Resumo

O Pecari tajacu é uma espécie das Américas presente em praticamente todos os biomas, porém está ameaçada na Mata Atlântica e Caatinga. Nesse sentido, faz-se necessário o desenvolvimento de técnicas reprodutivas e bancos de germoplasma para garantir a preservação do seu material genético. Desta forma, esse estudo objetivou estabelecer um protocolo de avaliação da integridade do DNA de células testiculares utilizando o marcador Laranja de Acridina (LA), durante o desenvolvimento in vitro. Cinco pares de testículos de machos pré-púberes provenientes do Centro de Multiplicação de Animais Silvestres (CEMAS) foram coletados, fragmentados e separados em dois grupos, o fresco (controle) e o cultivado. O cultivado foi submetido a um cultivo organotípico durante 56 dias com retiradas a cada 14 dias. Para analisar a integridade do DNA, as células foram isoladas por digestão enzimática com colagenase IV à 37°C, incubadas com LA e brometo de etídio. As amostras foram avaliadas sob microscópio de epifluorescência e classificadas como viáveis (V) quando a célula apresentava núcleo verde claro uniforme, apoptótica precoce (AP) com núcleo verde não uniforme, apoptótica tardia (AT) com núcleo laranja brilhante não uniforme e necróticas (N) com núcleo laranja uniforme. Os dados foram expressos em média e erro padrão e analisados por ANOVA seguido do teste Tukey (P<0,05). No grupo fresco, foram observadas em média 69,4 ± 2,8% de V, 11,2 ± 2,8% de AP, 10,80 ± 3,1% de AT, e 8,6 ± 3,5% de N. Já para as amostras submetidas ao cultivo por 14 dias, 24,00 ± 7,1% V, com 8,8 ± 3,8% AP, 23,40 ± 3,8% AT, e 43,8 ± 10% N. Aos 28 dias as médias apresentadas foram de 25,6 ± 6,8% V, 5,4 ± 2,1% AP, 10,2 ± 3,9% AT, e 58,6 ± 11,8% N. Após 42 dias de cultivo, 26,20 ± 6,8% V, 4,4 ± 1,1% AP, 25,4 ± 9,1% AT, e 43,8 ± 13,6% N. Por fim, aos 56 dias, foram observadas 17,5 ± 1,5% V, 3,5 ± 0,5% AP, 2,5 ± 0,5% AT, e 76,5 ± 1,5% N. Assim, verificou-se que as amostras cultivadas independentemente do tempo apresentaram viabilidade todas semelhantes entre si (P>0,05) e inferiores ao controle fresco (P<0,05) pois durante a cultura, processos biológicos como encurtamento dos telômeros e senescência celular podem ser causados pelas condições do cultivo in vitro. Além disso, todas as amostras cultivadas independentemente do tempo foram semelhantes entre si e ao controle para a apoptose precoce, apoptose tardia e necrose (P>0,05). Adicionalmente, é valido ressaltar que o LA possibilitou a visualização de maneira adequada dos danos ao DNA das células testiculares, além de ser um método simples, rápido e de baixo custo. Portanto, conclui-se que a utilização do marcador Laranja de Acridina se configura em um método eficiente para a avaliação de integridade de DNA em células testiculares de cateto.